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科學家教你自制顯微鏡。

內容簡介:并不是所有的顯微鏡DIY科學家都是為解決特定科研問題才自己造顯微鏡的。對于德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所(Max Planck Institute for Biophysical Chemistry)的物理學家Stefan Hell而言,在顯微鏡中提出新的概念本身就是一個目標。對此,Hell指出,這是一個科學項目。他DIY顯微鏡是為了提出一個推動顯微技術發展的想法。

  在費城賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)攻讀生物工程博士學位時,Wesley Legant遇到了一個巨大的障礙:他有想法,但是實施這些想法的設備還不存在。


  Legant對細胞力學和運動有著濃厚的興趣,因此他開始開發測量細胞對其環境的作用力的工具,將熒光珠嵌入哺乳動物增殖細胞周圍的材料中。當細胞移動時,材料會變形,熒光珠的位置也會發生偏移。通過測量熒光珠的移動量,Legant便可以計算出細胞所施加的力。不過,他很難獲得準確的數據。Legant表示,這些工具是沒問題的,有問題的是市售顯微鏡。


  細胞在自己的力量下移動緩慢——最快的速度不過每分鐘幾微米——所以顯微鏡需要長時間地觀察細胞移動。為了跟蹤三維珠子,Legant不得不以高空間分辨率對整個空間進行成像。鑒于當時是二十世紀末二十一世紀初,所以可用的商業顯微鏡——點掃描和旋轉盤共聚焦顯微鏡 ——無法達到這個成像要求。


  Legant指出,實際上,這兩種技術的分辨率是足以完成讓他們想要做的跟蹤的,但是這些技術光敏性太強,太慢了。


  試想象一個透明的立方體。共聚焦顯微鏡可以讓科學家逐一捕捉立方體中的每一個點,然后逐漸構建一個3D圖像。為此,他們往樣品上垂直投射一束光線,采集立方體每個點處穿透的光線。但每次照射都會產生活性氧,從而損害樣品——Legant稱之為“光毒性”效應。并且,熒光團的熒光強度會隨著光照時間和次數的增加而減弱,也就是所謂的“光漂白”。


  在Legant的實驗中,每個3D圖像的獲取大約需要一分鐘。然后,他必須再等5分鐘才能拍下下一張照片,從而讓細胞有時間從光毒性中恢復過來,防止其在集齊所需數據之前死亡。雖然他確實能測量細胞施加的力,但精度沒有達到預期。


  為了解決這些問題,在其博士后研究階段,Legant轉移了焦點。他與霍華德?休斯醫學研究所珍利亞研究園區(Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus)的物理學家、顯微鏡專家Eric Betzig合作,即加入了小而不斷發展的顯微鏡DIY團體。


  實時成像


  搭建顯微鏡是一項復雜且耗時的挑戰,這需要一支技能合適的團隊來處理所涉及的光學、機械和計算機問題。但回報可能非常可觀。一個新的顯微鏡不僅僅可以推動生物學發展,還能推動顯微鏡科學自身的發展。


  在珍利亞研究園區,研究人員突破了神經科學和發育生物學的界限。這兩個領域都高度依賴顯微鏡和成像技術,珍利亞研究園區擁有大量的現成商業顯微鏡。但是,當需要的工具不存在的時候,科學家們不會坐等商業公司來開發——而是自己搭建。


  珍利亞研究園區的一位物理學家Philipp Keller指出,他們想開展新型的試驗,雖然商業顯微鏡達不到要求,但沒有關系,這會激勵他們自己去DIY顯微鏡。Keller的研究方向是探索斑馬魚和果蠅的神經系統發育。


  在21世紀中期,Keller在德國海德堡的歐洲分子生物學實驗室(European Molecular Biology Laboratory)工作時遇到了一個與Legant的問題類似的問題:他想跟蹤發育中的斑馬魚胚胎中的所有細胞,以了解它們如何移動,并聚結形成不同的組織和器官。但是,大多數現有的顯微鏡不能在不殺死細胞的情況下,長時間對這樣大的樣本(大約700毫米直徑的細胞球體)進行成像。


  研究者們可以自行調整顯微鏡的設計,改變參數,正如OpenSPIM.org網站上的那些顯微鏡一樣。


  鑒于此,Keller開始研究光片照明顯微鏡(light-sheet microscopy)——一種剛剛投入使用的技術。光片顯微鏡不是直接照亮整個樣品,而是將弱光聚焦,以低強度的“光片”直接投射到用戶想要成像的物體的焦平面上。高質量的相機可以在一次曝光中捕捉整個焦平面,并通過垂直移動焦平面,從而重建整個3D物體。


  Keller表示,光片顯微鏡是一種非常快速的成像技術,而且非常溫和。焦點以外的結構不會暴露于光線之下,因此也不會受到光損傷。鑒于當時沒有現成的顯微鏡適合Keller的研究,因此在2005年,他決定自己造一個。他的設計被稱為數碼掃描激光光譜熒光顯微鏡(Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscope, DSLM),它可以在90秒內捕獲正在發育的斑馬魚胚胎中的每個細胞。


  并不是所有的顯微鏡DIY科學家都是為解決特定科研問題才自己造顯微鏡的。對于德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所(Max Planck Institute for Biophysical Chemistry)的物理學家Stefan Hell而言,在顯微鏡中提出新的概念本身就是一個目標。對此,Hell指出,這是一個科學項目。他DIY顯微鏡是為了提出一個推動顯微技術發展的想法。


  最終,Hell成功了。2014年,Hell與斯坦福大學(Stanford University)的William Moerner以及Betzig共同獲得了諾貝爾化學獎,獲獎理由是發明超分辨熒光顯微鏡技術,使研究人員能夠在納米尺度下對生物結構進行成像。


  盡管Hell已經搭建和商業化了幾種顯微鏡的設計,但是很少有生物學家會去效仿,這很大程度上是因為商業制造商很快就會跟進并推出新的設計。他獲得了諾獎的設計——受激發射減損(stimulated emission depletion, STED)在1999年時耗費了他20萬美元。現在,STED顯微鏡可能只有半個鞋盒那么大,并且可以被連接到任何現有的共聚焦熒光顯微鏡上。Hell表示,還有幾家公司在制造光片顯微鏡。


  然而,Keller指出,光片顯微鏡領域還比較年輕,而且商業化系統明顯落后于最頂尖的設計至少七八年。鑒于此,他們沒辦法,只能自己搭建。


  這個過程既有利也有弊。定制系統在速度和分辨率方面可能領先數年,并且可以定制為專注于特定生物問題或系統。但這是以靈活性為代價的。在一些DIY系統中,要改變放大倍數可能都很難。定制系統需要花費寶貴的時間和精力進行設置和維護。


  美國馬里蘭州貝塞斯達國家心臟、肺和血液研究所(US National Heart, Lung, and Blood Institute)的細胞生物學家Clare Waterman指出,對那些愿意接受挑戰的人來說,回報是值得的。在20世紀90年代早期,Waterman使用了一種新的相機技術,開發了一種名為熒光散斑顯微鏡(fluorescent speckle microscopy)的技術。該技術可以研究細胞骨架和其它大型多蛋白復合物。她表示,好處是,有了這種技術,你能得到其他人得不到的答案。缺點是你必須自己解決所有的問題。但這樣其實很有趣!


  DIY指南


  無論是推進顯微鏡還是回答特定的生物問題,構建新顯微鏡的過程大致相同。Keller在這方面非常有經驗,他指出,過去每一年他們都在研發新的顯微鏡,他已經把工藝細化到了最基本的要素上了(見“十步DIY顯微鏡”)。一個好的顯微鏡團隊需要一個物理學家或生物醫學工程師以及四名專家:一位光學工程師來規劃光學布局;一位機械工程師來研究這些零件如何組合在一起;一位軟件開發人員來編程,以及一位計算機科學家將原始數據轉換成可用的圖像。


  十步DIY顯微鏡


  制作顯微鏡非常復雜。但霍華德?休斯醫學研究所珍利亞研究園區(Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus)的物理學家Philipp Keller把這個過程拆分成十個可行的步驟:


  ?就儀器的設計進行頭腦風暴。


  ?規劃和測試光學設計。


  ?使用計算機輔助設計軟件來設計主體和定制部件。


  ?訂購部件,并制造定制的機械和光學部件。


  ?借用組件來測試其性能和集成的簡易性。


  ?組裝原型。


  ?編碼顯微鏡控制軟件。


  ?根據性能細化自定義組件。


  ?進行原理驗證實驗。


  ?開發和改進圖像處理軟件。


  第一步是光學設計。這一步需要使用專門的軟件——Keller和Legant使用的是OpticStudio軟件(可從華盛頓州柯克蘭市的Zemax公司獲得)。這類軟件可以仿真,根據需要的分辨率和特性來安排激光器、透鏡、反射鏡和其它光學部件的正確分布。


  然后,機械工程師根據設計結果,思考如何把所有這些部分真實地融合在現實世界中,例如用螺栓把零件固定在光學平臺上。一位在珍利亞研究園區和Keller合作的機械工程師Brian Coop表示,在此之前,你看到的,只是一排漂浮在空中的鏡頭。這需要他來把這些設計落實。


  Coop指出,現階段最大的挑戰是其物理限制。當顯微鏡必須專注于幾微米乃至幾納米的尺寸時,幾乎不允許誤差的存在。鏡頭、透鏡和激光器需要精確對準,以產生有用的對焦圖像。Coop需要考慮的是怎么排除微小的變化(如金屬的熱膨脹)對對焦的影響。Coop指出,嚴格確保光學元件排布的準確性會讓后面的工作簡單一些。


  Coop在準備部件時,會盡可能多地使用現成的零件制造顯微鏡,或者重復使用以前的零件。但是每臺顯微鏡都至少有一些定制的部件,因此Coop必須自己去機器車間設計,甚至制造自己需要的部件。


  例如,Keller設計的最新的顯微鏡的樣品室具有端口,可方便四個物鏡浸入到樣本所在的液體介質中。但這樣,要確保鏡頭被嚴格密封,防止液體浸入,同時還要保證每個鏡頭都可以獨立移動。另外,由于物鏡之間的距離非常近,只有100微米的間隙,同時尺寸和形狀各不相同,所以Coop必須調整樣品室和密封,以適應各種可能的組合。他估計每個樣品室的設計和制作需要兩到三天時間,花費在800美元到1000美元之間。


  一旦光學和機械工程師完成了原型組裝,軟件開發人員和計算機科學家便會加入,開發軟件,以確保這些部件能夠正常工作,并能夠生成可用的圖像。許多顯微鏡制造商使用名為LabVIEW的商業軟件包來控制他們的顯微鏡。但據珍利亞研究員園區的程序員Daniel Milkie表示,當機器變得更加先進時,有時需要定制解決方案。


  Milkie表示,他們之所以設計新的工具和新型顯微鏡,其實是在突破硬件能力的極限,因此他們需要有專門的軟件來獲得最大的性能。該訣竅在于確保軟件具有足夠的靈活性,能夠快速調整以滿足新的要求,如更多的檢測器。鑒于此,Milkie選擇將代碼模塊化,這意味著軟件很容易整合新的元素,而不必從頭開始。


  但是,Milkie指出,軟件方面最大的挑戰是如何處理顯微鏡產生的大量數據。高速攝像機每秒可以產生千兆字節的數據,有些機器可以同時運行多臺攝像機。例如Betzig實驗室每年可以生成50-100兆兆字節的數據。既然有這么大量的數據生成,就需要一個解決方案。


  Milkie的成品看起來一點都不像傳統的顯微鏡。所有部件——鏡子、鏡頭、激光器、照相機和樣品室——都被連接到重量為幾噸的桌子上的各種支柱和夾具上,以防止顯微鏡受到振動的影響。Legant表示,這就像一個精致的樂高套件。


  Keller估計,從頭開始制造顯微鏡至少需要一年,但如果團隊可以回收利用前一代儀器的零件和軟件,則可以減少這個時間。而且由于設計需要越來越高級的定制,開發成本只會越來越高。Keller在2005年構建DSLM的成本約為5萬美元,而后來的機器需要10萬到20萬美元。他在2015年的最新版本——各向同性多視圖顯微鏡(isotropic multiview microscope)——成本高達100萬美元。Keller感慨,花5萬美金打造一個高級顯微鏡的日子一去不復返了。


  其它需要考慮的因素


  定制顯微鏡的使用也很復雜,因為通常用戶需要根據每個實驗,手動更改大量設置和校準——這是商業制造商極力避免的。不過Waterman指出,這不應該是一個障礙。這是你在顯微鏡入門課程中應該學習的基礎知識。


  已發表的、設計新顯微鏡系統的研究通常會介紹整個計劃和零件清單。針對那些想要DIY的人,珍利亞研究園區可以免費在線提供顯微鏡的計劃和軟件,并為搭建過程提供幫助。 Legant表示,現有耗時近20小時的視頻,指引用戶如何組裝和對齊零件。事實上,還有很多機構提供類似的免費資源。例如,美國國家生物醫學成像研究所(US National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering Section on High Resolution Optical Imaging)生物物理學家Hari Shroff提供的diSPIM.org網站、馬普分子細胞生物學和遺傳學研究所(Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics)Pavel Tomancak發育生物學實驗室建立的OpenSPIM.org網站,以及西班牙巴塞羅那光子科學研究所(Institute of Photonic Sciences)的Emilio Gualda負責的OpenSpinMicroscopy都提供了免費的各種光學顯微鏡配置計劃。


  但是,盡管基于已有計劃構建顯微鏡要比從頭開始設計更簡單,但仍需用戶具備光學、機械學、電子學、計算機程序設計和生物學方面的知識。Gualda指出,DIY顯微鏡最大的優勢就是價格。OpenSpinMicroscopy提供的選擇性平面照明顯微鏡(selective-plane illumination microscope)的商業版本價格約為20萬美元。Gualda估計,使用他的開源軟件和Arduino控制器等價格低廉的硬件,研究人員只需要5萬美元便可搭建同樣高質量的儀器了,其中大部分成本來自激光器和相機。而且你可以根據自己的需求定制顯微鏡。


  用戶可以從一些網上論壇上得到建議和交易提示。根據哈佛醫學院(Harvard Medical School)的分子生物學家Srigokul Upadhyayula的說法,2014年,他與Legant合作建立了第一個柵格激光層照顯微鏡(lattice light-sheet microscope)。這種合作代表了科學家工作方式的一大變化。這種情況是這個領域很少見的——過去大家都傾向于孤軍作戰。


  Legant現在準備在北卡羅來納大學(University of North Carolina)教堂山分校建立自己的實驗室。他打算繼續細胞生物學和顯微鏡設計的工作。他的第一個項目將是重新審視細胞如何移動的問題。他表示,他們最新的顯微鏡已經解決了技術問題——他們還沒有機會將它應用于這個特定問題。現在,Legant創造了完成這項工作所需要的工具,他可能終于會得到他多年來追求的答案。

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